四逆汤提取工艺的筛选
作者：凌家俊 周莉玲
单位：凌家俊(广州中医药大学信息网络管理中心，广州 510405)；周莉玲(广州中医药大学中药学院，广州 510405)
关键词：四逆汤/标准；中药工艺改进；乌头生物碱/标准；色谱法，高压液相
广州中医药大学学报000222摘要：四逆汤是中医临床上用于治疗亡阳厥逆证的传统有效方剂，由附子、甘草、干姜三味药组成。提取工艺的合理性对药物疗效的发挥起着关键性的作用。本研究以乌头碱类生物碱的含量作为指标，用高效液相色谱法作为检测方法，经过正交实验筛选，证明了：(1)全方的提取方法宜采用单煎混合法；(2)提取液的除杂最好采用超滤法；(3)干姜提取挥发油 之后应保留水提液。
中图分类号：R284.2 文献标识码：A
文章编号：1007-3213(2000)02-0167-03
, 百拇医药
传统的四逆汤是采取群药混煎的方法制备。考虑到有效成分的提取率、毒性成分的含量、提取物的状态是否符合制剂的需要等诸多因素，所以不能仅停留在常规的群药共煎法上。对于提取物的纯化和精制，与醇沉法相比较，超滤法有很多优越性，如可在常温下操作，不需反复加热和相态转溶，有利于保持中药成分的生物活性和物理、化学稳定性，并能阻留细菌和热原等。一般认为干姜的主要有效成分存在于挥发油中，但是，干姜提油后的残留液对整个制剂有效性的影响也不容忽视。下面仅以总的乌头碱类生物碱的含量作为定量检测指标，考察上述工艺的合理性。
1 实验材料
1.1 药材 制附子：毛茛科乌头Aconitum carmichaeli Debx.的子根的加工品；炙甘草：豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch的干燥根及根茎，按药典法炮制而成；干姜：姜科植物姜Zingiber officinalis Rosc.的干燥根茎。
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1.2 仪器 ①Fresenius F6/HF型透析器；②碟式微孔滤膜滤器及滤膜；③岛津UV-260型紫外分光光度计；④高压液相色谱仪HITACHI-63850 Chromatograph;⑤TL9302色谱工作站。
1.3 试剂 甲醇、浓盐酸、氨水、乙醚、三乙胺(均为分析纯)、双蒸水等。
1.4 对照品 乌头碱(aconitine)、次乌头碱(hypaconitine)、新乌头碱(mesaconitine)，均由中国药品生物制品鉴定所出品。
2 实验方法
按表1所示进行正交试验。
采用表2所示的L4(23)正交表安排试验，进行样品液的制备。
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以乌头碱类生物碱(aconitine_type alkaloids)[包括乌头碱(acoitine)、次乌头碱(hypaconitine)、新乌头碱(mesaconitine)以及各自的水解产物]作为检测的指标。
表1 正交试验水平、因素表 水平
A全方的
提取方法
B
除杂方法
C
干姜的
提取方法
1
, 百拇医药 单煎混合
醇沉
只取挥发油
2
群药共煎
超滤
取挥发油及水提液
表2 L4(23)正交试验安排表 试验号
A
全方的
提取方法
B
, http://www.100md.com 除杂方法
C
干姜的
提取方法
试号1
单煎混合
醇沉
只取挥发油
试号2
单煎混合
超滤
取挥发油及水提液
试号3
, 百拇医药
群药共煎
醇沉
取挥发油及水提液
试号4
群药共煎
超滤
只取挥发油
2.1 对照品的制备 分别精密称取3种乌头生物碱的对照品约0.5mg(乌头碱：0.54mg，次乌头碱0.65mg，新乌头碱0.60mg)置于2mL容量瓶中，以甲醇定容。
2.2 对照品水解物的制备 分别称取乌头碱、次乌头碱、新乌头碱对照品各2mg，置于2mL的容量瓶中，加水溶解。用小注射器吸取1.5mL，注入2mL的安瓿中，封口。然后在水浴中煮沸3h。取出，水浴上蒸干，残余物加甲醇定容至2mL。
, 百拇医药
2.3 供试液的制备 试号1样品的制备：附子用稀酸水(pH=1)回流提取，提取液经浓缩、离心，得附子液；甘草用稀氨水(pH=9)回流提取，提取液经浓缩、离心，得甘草液；干姜以蒸馏法提取挥发油；将附子液与甘草液混合，醇沉，减压回收乙醇，抽滤，微孔滤膜过滤；将干姜挥发油用吐温80溶解后，加入滤液中，加水定容，得试号1样品。
试号2样品的制备：附子液及甘草液的制备同试号1；干姜用蒸馏法提取挥发油，保留提油之后的药液，姜渣再加水回流2次，提取液与上面的保留液合并，浓缩、离心10min，得干姜液；将上述附子液、甘草液、干姜液混合，抽滤，超滤；然后再浓缩，二次超滤，将干姜挥发油用吐温80溶解后，加入滤液中，加水定容，得试号2样品。
试号3样品的制备：附子、干姜、甘草混合，回流，同时收集挥发油，合并回流提取液，离心、浓缩、醇沉、抽滤、微孔滤膜过滤后，加入用吐温80溶解后的干姜挥油，加水定容，得试号3样品。
, 百拇医药
试号4样品的制备：附子、甘草混合，回流提取，回流液经离心、抽滤、超滤、浓缩、超滤；干姜用蒸馏法提挥发油；将挥发油吐温80溶解后，加入滤液中，加水至定容，得试号4样品。
供试液的制备：量取上面制得的样品液各50mL，用氨水碱化成pH为10～11，于分液漏斗中用乙醚萃取，合并萃取液于分液漏斗中，用pH为2～3的盐酸水萃取，合并酸水提取液并用氨水碱化成pH为10～11，再用乙醚萃取，合并萃取液并挥干，用甲醇溶解定容为5mL得供试液。供试液经微孔滤膜过滤后待进样。
2.4 测定 ①测定方法：高效液相色谱法；②色谱仪：HITACHI-63850 Chromatograph;③色谱柱：Spherisorb C18,5u；④检测器：HITACHI Wavelength Tunable Effluent Monitor;⑤流动相：0.1%三乙胺-甲醇(2∶8)；⑥检测条件：流速0.1mL/min，波长240nm,灵敏度0.04AUFS；
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检验波长的确定：称取少量乌头碱及次乌头碱对照品，用甲醇溶解制成待测品，于UV-260型紫外分光光度计上扫描绘制吸收图谱，测得最大吸收波长均在240nm左右。
2.5 结果处理 以供试液中乌头碱类生物碱含量为指标。试号1～试号4的基本峰形相似(图1)，经与对照品(图2)及对照品水解物(图3)比较，并通过在样品中加入标准品的方法进行分析，确定A～H峰为3种乌头碱类生物碱及其水解产物的峰。在处理峰面积积分值时，A～D采取由开始起的基线的强制水平基线积分，E～H采取谷基线积分。
各样品的积分值见表3，正交试验结果的计算见表4。 表3 试号1～4的乌头碱类生物碱及
其水解物的峰面积积分值
试号1
试号2
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试号3
试号4
积分值1
1023472
1997838
343944
556671
积分值2
1135892
1798592
342018
564159
平均值
, 百拇医药
1079682
1898215
342981
560415
表4 原药材的提取方法及除杂方法
正交筛选的试验结果 试号
A
全方的
提取方法
B
除杂方法
C
, 百拇医药 干姜的
提取方法
试验值
1
单煎混合
醇沉
只取挥发油
1079682
2
单煎混合
超滤
取挥发油
及水提液
, 百拇医药
1898215
3
群药共煎
醇沉
取挥发油
及水提液
342981
4
群药共煎
超滤
只取挥发油
560415
K1
, 百拇医药
2977897
1422663
1640097
K2
903396
2458630
2241196
R
1037250.5
517983.5
300549.5
经过以上的正交试验，可以认为，提取及除杂方法的最佳方案为：A1B2C2，其中影响结果的主要因子是A(全方的提取方法)，其次是B(除杂质的方法)，即最佳方案为：全方采用单煎后再混合的方法对各药材进行提取，其中干姜需取其挥发油及水提液，在去除杂质时采取超滤的方法。
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3 讨论
3.1 四逆汤中主要有效成分含量检测指标的确定 休克属中医“厥证”的范畴，四逆汤治疗休克的药理作用，与它的强心作用有关。方中君药为附子，含有主要的强心成分。关于附子的强心成分，各文献的报道不同。有报道认为有效成分包括：双酯型生物碱、消旋去甲乌药碱(higenamine)、棍掌碱(coryneine)、去甲猪毛菜碱(salsolino)[1]、非生物碱部分及乌头碱类生物碱的水解产物[2]。其中消旋去甲乌药碱已由实验证明具有很强的强心活性。虽然有效成分可能很多，但有一点可以肯定，乌头碱类生物碱(aconitine_type alkaloids)具有较强的生理活性，既是有效成分又是毒性成分[3]，在中毒剂量以下，其含量应该尽可能高。所以，本实验以乌头碱类生物碱作为含量测定指标。此外，有人还以药理作用为指标比较了四逆汤的5种制备工艺的合理性。
3.2 关于超滤 超滤是一种膜分离技术，与醇沉法相比较，超滤可在常温下操作，不需反复加热和相态转溶，有利于保持中药成分的生物活性和物理、化学稳定性，并有阻留细菌和热原的作用。本实验证明采用超滤精制四逆汤提取液，对于保证制剂的疗效和澄明度以及去除热原有利。在实际的生产中，超滤的流程简单，生产周期短，节约能耗，并能节约大量乙醇，从而降低了生产成本。因此，超滤在提取物的纯化和精制中，尤其是在中药注射液[4]和口服液的制备中，是很有应用前途的。
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本研究中采用F6/HF型透析柱(HenmoflowF6)模拟超滤设备。F6/HF型透析柱由8000～15000根毛细血管样的空心纤维构成，以聚砜膜(polysulfon,Psu)为模材的空心纤维透析器(hollow_fiber dialyzer)，其超滤系数(ultrafiltration coefficient,K)为5.5kUF，分子量截留值小于35000。
图1 试号1样品的HPLC图谱
图2 3种对照品的HPLC图谱
D：新乌头碱；E：乌头碱；G：次乌头碱
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图3 3种对照品水解物的HPLC图谱
A，B，C：3种对照品水解物均有的峰；F：新乌头碱水解物；H：乌头碱水解物
作者简介：第一作者，凌家俊 男，1971年7月出生，助教，硕士
参考文献：
[1]陈迪华，梁晓天.中药附子成分研究[J].药学学报，1982，17(10)：792
[2]江京莉，周远鹏.附子的药理作用和毒性[J].中成药，1994，13(12)：37
[3]侯世祥，何琴，周蛲棠，等.中药浸出因素考察及效果评价[J].中草药，1996，27(3)：143
[4]郝丽.超滤法制备丹参注射液的工艺研究[J].中草药，1996，27(8)：471
收稿日期：1999-11-02, 百拇医药
单位：凌家俊(广州中医药大学信息网络管理中心，广州 510405)；周莉玲(广州中医药大学中药学院，广州 510405)
关键词：四逆汤/标准；中药工艺改进；乌头生物碱/标准；色谱法，高压液相
广州中医药大学学报000222摘要：四逆汤是中医临床上用于治疗亡阳厥逆证的传统有效方剂，由附子、甘草、干姜三味药组成。提取工艺的合理性对药物疗效的发挥起着关键性的作用。本研究以乌头碱类生物碱的含量作为指标，用高效液相色谱法作为检测方法，经过正交实验筛选，证明了：(1)全方的提取方法宜采用单煎混合法；(2)提取液的除杂最好采用超滤法；(3)干姜提取挥发油 之后应保留水提液。
中图分类号：R284.2 文献标识码：A
文章编号：1007-3213(2000)02-0167-03
, 百拇医药
传统的四逆汤是采取群药混煎的方法制备。考虑到有效成分的提取率、毒性成分的含量、提取物的状态是否符合制剂的需要等诸多因素，所以不能仅停留在常规的群药共煎法上。对于提取物的纯化和精制，与醇沉法相比较，超滤法有很多优越性，如可在常温下操作，不需反复加热和相态转溶，有利于保持中药成分的生物活性和物理、化学稳定性，并能阻留细菌和热原等。一般认为干姜的主要有效成分存在于挥发油中，但是，干姜提油后的残留液对整个制剂有效性的影响也不容忽视。下面仅以总的乌头碱类生物碱的含量作为定量检测指标，考察上述工艺的合理性。
1 实验材料
1.1 药材 制附子：毛茛科乌头Aconitum carmichaeli Debx.的子根的加工品；炙甘草：豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch的干燥根及根茎，按药典法炮制而成；干姜：姜科植物姜Zingiber officinalis Rosc.的干燥根茎。
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1.2 仪器 ①Fresenius F6/HF型透析器；②碟式微孔滤膜滤器及滤膜；③岛津UV-260型紫外分光光度计；④高压液相色谱仪HITACHI-63850 Chromatograph;⑤TL9302色谱工作站。
1.3 试剂 甲醇、浓盐酸、氨水、乙醚、三乙胺(均为分析纯)、双蒸水等。
1.4 对照品 乌头碱(aconitine)、次乌头碱(hypaconitine)、新乌头碱(mesaconitine)，均由中国药品生物制品鉴定所出品。
2 实验方法
按表1所示进行正交试验。
采用表2所示的L4(23)正交表安排试验，进行样品液的制备。
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以乌头碱类生物碱(aconitine_type alkaloids)[包括乌头碱(acoitine)、次乌头碱(hypaconitine)、新乌头碱(mesaconitine)以及各自的水解产物]作为检测的指标。
表1 正交试验水平、因素表 水平
A全方的
提取方法
B
除杂方法
C
干姜的
提取方法
1
, 百拇医药 单煎混合
醇沉
只取挥发油
2
群药共煎
超滤
取挥发油及水提液
表2 L4(23)正交试验安排表 试验号
A
全方的
提取方法
B
, http://www.100md.com 除杂方法
C
干姜的
提取方法
试号1
单煎混合
醇沉
只取挥发油
试号2
单煎混合
超滤
取挥发油及水提液
试号3
, 百拇医药
群药共煎
醇沉
取挥发油及水提液
试号4
群药共煎
超滤
只取挥发油
2.1 对照品的制备 分别精密称取3种乌头生物碱的对照品约0.5mg(乌头碱：0.54mg，次乌头碱0.65mg，新乌头碱0.60mg)置于2mL容量瓶中，以甲醇定容。
2.2 对照品水解物的制备 分别称取乌头碱、次乌头碱、新乌头碱对照品各2mg，置于2mL的容量瓶中，加水溶解。用小注射器吸取1.5mL，注入2mL的安瓿中，封口。然后在水浴中煮沸3h。取出，水浴上蒸干，残余物加甲醇定容至2mL。
, 百拇医药
2.3 供试液的制备 试号1样品的制备：附子用稀酸水(pH=1)回流提取，提取液经浓缩、离心，得附子液；甘草用稀氨水(pH=9)回流提取，提取液经浓缩、离心，得甘草液；干姜以蒸馏法提取挥发油；将附子液与甘草液混合，醇沉，减压回收乙醇，抽滤，微孔滤膜过滤；将干姜挥发油用吐温80溶解后，加入滤液中，加水定容，得试号1样品。
试号2样品的制备：附子液及甘草液的制备同试号1；干姜用蒸馏法提取挥发油，保留提油之后的药液，姜渣再加水回流2次，提取液与上面的保留液合并，浓缩、离心10min，得干姜液；将上述附子液、甘草液、干姜液混合，抽滤，超滤；然后再浓缩，二次超滤，将干姜挥发油用吐温80溶解后，加入滤液中，加水定容，得试号2样品。
试号3样品的制备：附子、干姜、甘草混合，回流，同时收集挥发油，合并回流提取液，离心、浓缩、醇沉、抽滤、微孔滤膜过滤后，加入用吐温80溶解后的干姜挥油，加水定容，得试号3样品。
, 百拇医药
试号4样品的制备：附子、甘草混合，回流提取，回流液经离心、抽滤、超滤、浓缩、超滤；干姜用蒸馏法提挥发油；将挥发油吐温80溶解后，加入滤液中，加水至定容，得试号4样品。
供试液的制备：量取上面制得的样品液各50mL，用氨水碱化成pH为10～11，于分液漏斗中用乙醚萃取，合并萃取液于分液漏斗中，用pH为2～3的盐酸水萃取，合并酸水提取液并用氨水碱化成pH为10～11，再用乙醚萃取，合并萃取液并挥干，用甲醇溶解定容为5mL得供试液。供试液经微孔滤膜过滤后待进样。
2.4 测定 ①测定方法：高效液相色谱法；②色谱仪：HITACHI-63850 Chromatograph;③色谱柱：Spherisorb C18,5u；④检测器：HITACHI Wavelength Tunable Effluent Monitor;⑤流动相：0.1%三乙胺-甲醇(2∶8)；⑥检测条件：流速0.1mL/min，波长240nm,灵敏度0.04AUFS；
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检验波长的确定：称取少量乌头碱及次乌头碱对照品，用甲醇溶解制成待测品，于UV-260型紫外分光光度计上扫描绘制吸收图谱，测得最大吸收波长均在240nm左右。
2.5 结果处理 以供试液中乌头碱类生物碱含量为指标。试号1～试号4的基本峰形相似(图1)，经与对照品(图2)及对照品水解物(图3)比较，并通过在样品中加入标准品的方法进行分析，确定A～H峰为3种乌头碱类生物碱及其水解产物的峰。在处理峰面积积分值时，A～D采取由开始起的基线的强制水平基线积分，E～H采取谷基线积分。
各样品的积分值见表3，正交试验结果的计算见表4。 表3 试号1～4的乌头碱类生物碱及
其水解物的峰面积积分值
试号1
试号2
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试号3
试号4
积分值1
1023472
1997838
343944
556671
积分值2
1135892
1798592
342018
564159
平均值
, 百拇医药
1079682
1898215
342981
560415
表4 原药材的提取方法及除杂方法
正交筛选的试验结果 试号
A
全方的
提取方法
B
除杂方法
C
, 百拇医药 干姜的
提取方法
试验值
1
单煎混合
醇沉
只取挥发油
1079682
2
单煎混合
超滤
取挥发油
及水提液
, 百拇医药
1898215
3
群药共煎
醇沉
取挥发油
及水提液
342981
4
群药共煎
超滤
只取挥发油
560415
K1
, 百拇医药
2977897
1422663
1640097
K2
903396
2458630
2241196
R
1037250.5
517983.5
300549.5
经过以上的正交试验，可以认为，提取及除杂方法的最佳方案为：A1B2C2，其中影响结果的主要因子是A(全方的提取方法)，其次是B(除杂质的方法)，即最佳方案为：全方采用单煎后再混合的方法对各药材进行提取，其中干姜需取其挥发油及水提液，在去除杂质时采取超滤的方法。
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3 讨论
3.1 四逆汤中主要有效成分含量检测指标的确定 休克属中医“厥证”的范畴，四逆汤治疗休克的药理作用，与它的强心作用有关。方中君药为附子，含有主要的强心成分。关于附子的强心成分，各文献的报道不同。有报道认为有效成分包括：双酯型生物碱、消旋去甲乌药碱(higenamine)、棍掌碱(coryneine)、去甲猪毛菜碱(salsolino)[1]、非生物碱部分及乌头碱类生物碱的水解产物[2]。其中消旋去甲乌药碱已由实验证明具有很强的强心活性。虽然有效成分可能很多，但有一点可以肯定，乌头碱类生物碱(aconitine_type alkaloids)具有较强的生理活性，既是有效成分又是毒性成分[3]，在中毒剂量以下，其含量应该尽可能高。所以，本实验以乌头碱类生物碱作为含量测定指标。此外，有人还以药理作用为指标比较了四逆汤的5种制备工艺的合理性。
3.2 关于超滤 超滤是一种膜分离技术，与醇沉法相比较，超滤可在常温下操作，不需反复加热和相态转溶，有利于保持中药成分的生物活性和物理、化学稳定性，并有阻留细菌和热原的作用。本实验证明采用超滤精制四逆汤提取液，对于保证制剂的疗效和澄明度以及去除热原有利。在实际的生产中，超滤的流程简单，生产周期短，节约能耗，并能节约大量乙醇，从而降低了生产成本。因此，超滤在提取物的纯化和精制中，尤其是在中药注射液[4]和口服液的制备中，是很有应用前途的。
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本研究中采用F6/HF型透析柱(HenmoflowF6)模拟超滤设备。F6/HF型透析柱由8000～15000根毛细血管样的空心纤维构成，以聚砜膜(polysulfon,Psu)为模材的空心纤维透析器(hollow_fiber dialyzer)，其超滤系数(ultrafiltration coefficient,K)为5.5kUF，分子量截留值小于35000。
图1 试号1样品的HPLC图谱
图2 3种对照品的HPLC图谱
D：新乌头碱；E：乌头碱；G：次乌头碱
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图3 3种对照品水解物的HPLC图谱
A，B，C：3种对照品水解物均有的峰；F：新乌头碱水解物；H：乌头碱水解物
作者简介：第一作者，凌家俊 男，1971年7月出生，助教，硕士
参考文献：
[1]陈迪华，梁晓天.中药附子成分研究[J].药学学报，1982，17(10)：792
[2]江京莉，周远鹏.附子的药理作用和毒性[J].中成药，1994，13(12)：37
[3]侯世祥，何琴，周蛲棠，等.中药浸出因素考察及效果评价[J].中草药，1996，27(3)：143
[4]郝丽.超滤法制备丹参注射液的工艺研究[J].中草药，1996，27(8)：471
收稿日期：1999-11-02, 百拇医药
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